Progetto inerente lo svolgimento della tesi di Dottorato in Sintesi Chimica ed Enzimatica Applicata, XXII ciclo, presentato dal Dottorando Cosimo Ducani

PROGETTO DI RICERCA Dottorato in Sintesi Chimica ed Enzimatica Applicata Sede Amministrativa :Università degli Studi di Bari Sede Consorziata: Università del Salento Il meccanismo classico d’azione del cisplatino, cis-[PtCl2(NH3)2], somministrato per iniezione endovenosa, prevede che nel plasma sanguigno eventuali processi d’idrolisi del farmaco siano repressi per la concentrazione relativamente alta di Cl- (≈ 100 mM). Il mantenimento dei cloruri nella sfera di coordinazione riduce fortemente la reattività e la tossicità del cisplatino. L’ingresso nell’ambiente cellulare avviene principalmente per diffusione passiva attraverso la membrana citoplasmatica. Successivamente, nel citoplasma, dove la concentrazione degli ioni cloruro è più bassa (3-4 mM), la forma preponderante del cisplatino diventa la mono-acquo specie, cis-[PtCl(H2O)(NH3)2]. In questa forma il complesso è molto più reattivo, verso agenti nucleofili, sia per la labilità dell’acqua come legante che per la presenza di una carica positiva netta. Come ben sappiamo il principale bersaglio del farmaco è il DNA, e i principali gruppi donatori sono le basi puriniche, in particolare se si escludono gli atomi di azoto protonati o coinvolti in legami ad idrogeno, restano, come possibili siti d’attacco del farmaco, l’N7 e l’N3 guaninico (G) o adeninico (A). Molti dati sperimentali, incluse misurazioni delle costanti di stabilità, indicano che, a pH neutro, l’N7 guaninico e poi quello adeninico sono i siti di legame preferenziali al DNA12-13, sia dal punto di vista elettronico che dal punto di vista sterico, poiché l’N7 si trova nel solco maggiore del DNA. Durante l’attività di dottorato, fra gli obiettivi c’è quello di dimostrare, almeno in vitro (con l’utilizzo di polimerasi sia batteriche che eucariotiche) l’ipotesi secondo la quale alla classica platinazione diretta del DNA, operata nel caso del cisplatino dalla mono-acquo specie, formata per idrolisi parziale, si possa affiancare un meccanismo di platinazione parallelo, con l’inserimento di addotti contenenti singole basi puriniche legate al Pt(II), durante la sintesi di acidi nucleici. Si ritiene probabile quanto detto poiché sicuramente le basi puriniche libere sono dei nucleofili molto più efficienti del DNA, almeno dal punto di vista cinetico, per il minore ingombro sterico. Inoltre è riconosciuto come non sia necessario un livello di platinazione del DNA cellulare particolarmente elevato, per indurre processi apoptotici. Questo garantisce che anche in presenza di una forte specificità delle DNA polimerasi, verso l’inserimento di basi non platinate, l’erroneo inserimento, di tanto in tanto, di una base purinica platinata, possa essere sufficiente a produrre gli effetti farmacologici osservati, come l’apoptosi. Questa ipotesi può aprire nuove prospettive per lo sviluppo di nuovi farmaci antitumorali e/o antivirali a base di platino, in particolare, consentire la realizzazione di nuove molecole più idonee al trattamento di tumori normalmente resistenti ai composti chemioterapici attualmente in uso. I complessi sintetizzati saranno somministrati a cellule tumorali per testare la citotossicità, mediante saggio dell’MTT (3-[4,5-dimetiltiazolo-2-il]-2,5-difenilbromuro di tetrazolio), e la localizzazione nelle diverse frazioni cellulari sarà valutata grazie all’utilizzo di strumentazioni quali l’ICP-AES, che permetterebbe di valutare anche i livelli di uptake cellulare e di platinazione del DNA. L’incorporazione nel DNA di nucleotidi legati a gruppi funzionali ha anche una serie di importanti applicazioni tecnologiche. Infatti una serie di molecole marker come la digossigenina, la biotina e fluorofori, legate covalentemente a nucleotidi, sono già ampiamente usate per la sintesi di acidi nucleici modificati.1-2 D’altra parte esistono una serie di studi sulla struttura e sulle proprietà di nucleotidi, oligonucleotidi, DNA ed RNA legati a metalli o complessi metallici.3-11 Durante il dottorato saranno sintetizzati e caratterizzati complessi contenenti metalli (soprattutto platino) legati covalentemente in N7 a nucleosidi e nucleotidi purinici del tipo: [Pt(dien)(N7-G)] (dien = dietilentriammina) (schema 1B) oppure [Pt(NH3)3(N7-G)] dove G rappresenta un nucleoside/nucleotide guaninico. Questi complessi saranno utilizzati per dimostrare che è possibile una loro incorporazione nella catena del DNA. Fino ad oggi, oligonucleotidi e DNA platinato erano stati ottenuti prevalentemente per incubazione dell’acido nucleico con complessi del platino. Per raggiungere questo obiettivo saranno utilizzate delle tecniche di primer extension (PE) e polymerase chain reaction (PCR). L’incorporazione di nucleotidi in una catena di DNA apre nuove possibilità in campo farmacologico e nello studio del meccanismo d’azione del cisplatino. Schema 1. La sintesi di oligonucleotidi metallati suggerisce anche delle possibili applicazioni nel campo della biologia molecolare. In effetti negli ultimi anni fra le tecniche utilizzate per il controllo dell’espressione genica ci sono quelle che utilizzano degli oligonucleotidi modificati chimicamente.14-15 Per questo motivo una prospettiva del mio lavoro di ricerca potrebbe essere di testare un possibile knockdown di geni in embrioni di zebrafish (o in altri animali modello) con l’utilizzo di oligonucleotidi modificati con complessi metallici. Infine, sempre fra le prospettive ci potrebbero essere anche delle applicazioni di tipo nanotecnologico con l’utilizzo di oligonucletidi metallati in maniera sito specifica (utilizzando metalli paramagnetici) da sfruttare come molecular memory. Bibliografia 1 Tasara, T.; Angerer, B.; Damond, M.; Winter, H.; Dörhöfer, S.; Hübscher, U.; Amacker, M. Nucleic Acids Res. 2003, 31, 2636. 2 Edwards, J. R.; Itagaki, Y.; Ju, J. Nucl. Acids Res. 2001, 29, e104. 3 Wang, D.; Lippard, S. J. Nat. Rev. Drug Disc. 2005, 4, 307. 4 Jamieson, E. R.; Lippard, S. J. Chem. Rev. 1999, 99, 2467. 5 Natile, G.; Marzilli, L. G. Coord. Chem. Rev. 2006, 250, 1315. 6 Benedetti, M.; Tamasi, G.; Cini, R.; Marzilli, L. G.; Natile, G. Chem. Eur. J. 2007, 13, 3131 and references. 7 Wong, E.; Giandomenico, C. M. Chem. Rev. 1999, 99, 2451. 8 Reedijk, J. Chem. Rev. 1999, 99, 2499. 9 Isab, A. A.; Marzilli, L. G. Inorg. Chem. 1998, 37, 6558. 10 Brabec, V.; Kasparkova, J. 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